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    謝卡斌課題組在改進細菌16S rRNA基因高通量測序方法研究上有新進展
    發布時間:2020-06-04

    近日,作物遺傳改良國家重點實驗室謝卡斌課題組在Microbiome發表了題為“Engineering CRISPR/Cas9 to mitigate abundant host contamination for 16S rRNA gene-based amplicon sequencing”的研究論文,論文報道了一種改進的細菌16S rRNA基因高通量測序方法。

    圖1. Cas-16S-seq方法示意圖

    Cas-16S-seq方法示意圖

    16S-seq是微生物組學研究最常用的方法,而大量葉綠體和線粒體序列污染是16S-seq分析植物微生物組的一大難題。該研究巧妙地利用CRISPR/Cas9系統靶向消除16S-seq測序文庫中的宿主序列,保留完整的細菌16S rRNA基因信息,提高了16S-seq分析植物樣品的靈敏度和效率。

    微生物組對動植物健康具有重要意義。對植物微生物組的深入研究將為調控植物生長、增強作物抗逆性、減少植物病害以及促進農業可持續發展提供新的策略。16S-seq是研究細菌群落結構的常用方法。然而,線粒體和葉綠體存在和細菌同源的16S rRNA基因,因此植物樣品的16S-seq數據中會有最高可達99%以上的宿主16S rRNA序列,嚴重影響了16S-seq在植物中的應用。

    圖2. Cas-16S-seq與常規16S-seq分析水稻葉片樣品的結果比較

    Cas-16S-seq與常規16S-seq分析水稻葉片樣品的結果比較

    在本研究中,謝卡斌課題組開發了名為Cas-16S-seq的方法,該方法利用Cas9核酸酶和特異的向導RNA(gRNA)切割16S-seq測序文庫中的植物16S rRNA靶標,從而消除或減少宿主序列污染。該研究以前期CRISPR-Plant所使用的gRNA設計工具為基礎,建立了一套生物信息學流程,通過比較植物與細菌的16S rRNA基因序列,設計了靶向水稻16S rRNA的高特異性gRNA。研究人員分別以人工混合樣品、稻田土壤、水稻根系和水稻葉片樣品為例,對Cas-16S-seq和常規16S-seq的數據進行了比較。

    研究結果表明 Cas-16S-seq顯著降低了水稻16S rRNA基因序列的比例:根系樣品中,水稻的序列從63.2%降至2.9%;葉片樣品中,從99.4%降至11.6%。因此與常規16S-seq相比,Cas-16S-seq能檢測到的細菌信息有了大幅度的提高。我們的分析結果也表明Cas-16S-seq特異性高,沒有檢測到gRNA脫靶切割樣品中細菌16S rRNA基因的現象,說明該方法不會引入人為偏差。

    該研究解決了16S-seq分析植物樣品時大量宿主序列污染的難題,為植物微生物組學研究提供了一個強有力的工具,也為優化微生物組學研究工具提供新思路。

    植物科學技術學院2018級博士研究生宋露洋為論文第一作者,謝卡斌教授為論文通訊作者。

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